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PCR技术的原理是什么

发布时间：2025-10-09 | 来源：互联网转载和整理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（&m;g=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

温度与时间的设置

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。

PCR反应特点

特异性强PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

操作步骤

(1)变性：双链DNA在94℃条件下，通过热变性使模板的双链DNA氢键断裂变成单链。

(2)复性：当变性温度突然降至引物Tm值(通常为35～65℃)以下时，会使引物与模板DNA互补序列杂交。由于引物一般由10～25个碱基序列，模板DNA结构远比引物分子复杂，且反应体系中引物分子的浓度又远大于模板DNA，故在退火温度时，引物与模板DNA容易结合形成互补链。

(3)延伸：在DNA聚合酶的作用下，以DNA为模板和以4种脱氧核糖核苷酸为原料，在Mg2+存在的条件下。DNA聚合酶依赖于其5→3的聚合酶活力，以引物结合于DNA模板链为起始点。使引物的序列得以延伸，合成模板DNA的互补链。