pcr实验流程图(pcr实验程序)
发布时间：2025-10-07 | 来源：互联网转载和整理
pcr实验流程图(pcr实验程序)
1、1/4 在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
pcr实验流程图(pcr实验程序)
2、 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
3、2/4调整好反应程序。
4、将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
5、一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。
pcr实验流程图(pcr实验程序)
6、 3/4 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
7、4/4PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
8、 PCR反应体系的组成与反应条件的优化 PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。
9、各个组份都能影响PCR结果的好坏。
10、 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。
11、标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。
12、Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。
13、浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。
14、在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。
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